Abbau von Peptidketten

Guten Tag und herzlich willkommen. Dieses Video heißt: Abbau von Peptidketten. An Vorkenntnissen solltest du Wissen über Aminosäuren, Peptide, Amide, die Hydrolyse von Amiden, sowie über Amine und Carbonsäuren mitbringen. Ziel des Videos ist es, grundlegende Vorstellungen über den Peptidabbau und die Analyse von Peptiden zu vermitteln. Der Film ist in fünf Abschnitte unterteilt: 1. Sinnvoller Abbau 2. Hydrolyse 3. Totalhydrolyse 4. Sequenzanalyse 5. Zusammenfassung   1. Sinnvoller Abbau Nehmen wir einmal an, wir haben es mit diesem Molekül zu tun, das ihr sicher schon als Dipeptid erkannt habt. Wie kann man einen Abbau des Moleküls gestalten, um etwas über die Struktur zu erfahren? Eine Möglichkeit wäre die Verbrennung im Sinne einer CHN-Analyse, um etwas über die beteiligten Elemente und ihren Anteil am Bau des Moleküls zu erfahren. Obwohl prinzipiell richtig, ist diese Methode hier nicht sinnvoll einsetzbar, da wir bereits wissen, dass wir es mit Peptiden zu tun haben. Die CHN-Analyse liefert praktisch keine brauchbaren Aussagen über die Struktur eines Moleküls. Wir haben von vornherein schon gewisse Vorstellungen über die Primärstruktur eines Peptids. Das ist ganz offensichtlich, denn wir kennen seine Bausteine, die Aminosäuren. Sinnvoller hingegen ist es, eine Spaltung des Peptids durchzuführen, um schließlich zu den einzelnen Aminosäuren zu gelangen.   2. Hydrolyse Hydrolyse bedeutet Spaltung unseres Peptids durch Wasser. Wir erinnern uns, dass diese Hydrolyse sowohl im sauren, als auch im basischen (alkalischen) Medium stattfinden kann. Somit erhalten wir nach der sauren Variante die Kationen, der am Bau des Peptids beteiligten Aminosäuren. Basische Hydrolyse hingegen führt zu den entsprechenden Anionen der Aminosäuren. Und selbstverständlich läuft die Hydrolyse nur in Anwesenheit von Wasser ab. Nach Bestimmung der Aminosäuren können wir eine Aussage über unser Dipeptid machen. Es besteht aus den beiden Aminosäuren Glyzin und Alanin, wobei es zwei mögliche Isomere gibt. Die basische Hydrolyse hat gegenüber der sauren Hydrolyse zwei wesentliche Nachteile. Als Erstes kann es zu einer Veränderung einiger Aminosäuren kommen. Als Zweites ist die Racemisierung am Alphakohlenstoffatom nicht wünschenswert. Aus diesen Gründen zieht man die saure Hydrolyse der basischen vor.   3. Totalhydrolyse Total bedeutet vollständig, das heißt, mit dieser Hydrolyse soll das Peptidmolekül vollständig hydrolysiert werden. Die Hydrolyse eines Peptidmoleküls kann durch entsprechende Enzyme vonstattengehen. Diese Enzyme nennt man Proteasen oder Peptidasen. Die Enzyme rufen einen biochemischen Abbau hervor. Durch starke Säuren findet ein chemischer Abbau statt. Die Totalhydrolyse von Peptiden, die für die Analyse verwendet wird, möchte ich kurz vorstellen. Die Reaktion findet in einer 6-Molaren-Salzsäure statt. Die Reaktionszeit beträgt 24 Stunden. Die Reaktionszeit liegt bei 105 Grad Celsius. Die Reaktion findet im geschlossenen Rohr statt, damit Chlorwasserstoff und Wasser nicht entweichen können. Unter diesen Bedingungen findet eine Totalhydrolyse statt. Das entstandene Hydrolysat wird für weitere analytische Zwecke verwendet. Im Hydrolysat liegt ein Gemisch von Aminosäuren vor. Das Hydrolysat wird nun der weiteren Analyse zugeführt. Die weitere Untersuchung findet im Wesentlichen automatisch statt. Das Hydrolysat gelangt in den Aminosäuren-Analysator. Die Aminosäuren werden mit dem Verfahren der Ionenaustauschchromatografie getrennt. Den einzelnen Aminosäurenfraktionen wird Ninhydrin zugesetzt. Es bildet sich der bekannte violette Farbstoff. Dieser Farbstoff wird einer quantitativen Analyse unterzogen, indem die Farbintensität untersucht wird. Mit dem vorgestellten Verfahren können Stoffmengen ab 25 nmol, das sind 25×10^-9 mol untersucht werden. Wir kennen nun die beteiligten Aminosäuren und ihre Mengen an der Struktur des Peptids. Wir besitzen jedoch noch keinerlei Aussage über die Sequenz der Aminosäuren.

Aus diesem Grund schließt sich 4. Die Sequenzanalyse an. Nehmen wir an, wir haben ein Tripeptid bestehend aus den Aminosäuren Glyzin, Alanin und Phenylalanin. In einem der vorigen Videos haben wir gelernt, dass dieses Tripeptid 6 Konstitutionsisomere bilden kann. Wir wollen nun die Anordnung der Aminosäurenmoleküle im Tripeptid untersuchen. Wir wollen etwas über ihre Sequenz erfahren. Die Kenntnis der Sequenz ist ein weiterer Schritt in Richtung einer vollständigen Strukturaufklärung des Tripeptids. Die Totalsynthese aus Abschnitt 3 ist dafür ungeeignet. Wir benötigen einen stufenweisen Abbau. Eine Möglichkeit, dieses Anliegen zu bewerkstelligen, ist der sogenannte EDMAN-Abbau. Bei dieser Methode führen Nebenprodukte zu Verschmutzungen, sodass man nur 30 bis 40 Stufen vollziehen kann. Daher wird der stufenweise Abbau häufig mit einer Partialhydrolyse des Peptids kombiniert. Die Peptidkette wird weder total noch stufenweise abgebaut, sondern an bestimmten Stellen auseinandergeschnitten. Das geschieht mit bestimmten Enzymen: mit Proteinasen und Peptidasen. Diese sind in der Lage, die Peptidkette an ausgewählten Stellen zu hydrolysieren. Zwei typische Vertreter sind Trypsin und Chymotrypsin. Die analytische Untersuchung wird kombiniert mit den Verfahren Massenspektronometrie (MS), mit FAB, MALDI und ESI.   5. Zusammenfassung Um ein Peptidmolekül, wie dieses Dipeptid abzubauen, sind mehrere Schritte notwendig. Wir wollen Antworten auf zwei wichtige Fragen erhalten. 1. Welche Aminosäuren und in welcher Anzahl sind am Bau des Peptidmoleküls beteiligt? 2. Welche Sequenz haben die beteiligten Aminosäuren? Peptidmoleküle sind durch Hydrolyse in Aminosäuren spaltbar. Die saure Hydrolyse ist der basischen Hydrolyse vorzuziehen. Nach erfolgter Totalhydrolyse des Peptids werden die Aminosäuren mit Ionenaustauschchromatografie getrennt. Die Aminosäuren werden quantitativ bestimmt und wir erhalten eine Aussage über die mengenmäßige Zusammensetzung der Aminosäuren im Peptidmolekül. Eine Aussage über die Primärstruktur der Peptidketten liefert die Sequenzanalyse. Sequenzanalyse geschieht durch EDMAN‘schen Abbau. Bei großen Peptidketten ist dieser mit der Partialhydrolyse gekoppelt. Für die analytischen Untersuchungen werden die Methoden Massenspektronometrie (MS), MALDI, FAB und ESI verwendet. Somit gelingt es zweitens, die Sequenz einer Peptidkette zu ermitteln.   Ich danke für die Aufmerksamkeit. Alles Gute und auf Wiedersehen!